收样前请注意 注意事项 1/放线菌酮：处理细胞的胰酶与PBS中尽量也加放线菌酮。 2/建议用尖底的冻存管，便于离心收集沉淀。 3/建议液氮速冻时间5min以上,再转移到-80冰箱。 4/为确保实验的顺利，强烈建议同一样品准备2份，以防部分样品降解时，还需重新取材、制备或送样，耽误宝贵时间。 5/收样的细胞，如无特殊要求，需保证细胞处于指数生长期，细胞不能长的太满。接触抑制会严重影响细胞的翻译状态！ 6/收样过程动作尽量轻柔且快速，避免样品反复冻融。 7/其余样品类型收样详情可联系工作人员。 01生物学重复 取样过程中，为了减少人为造成的样品间差异，可以采取如下措施：取样时间、部位、处理条件、操作过程等方面尽可能保持一致，否则会影响实验结果的可重复性和可信度。 02样品的保存 取样后，在简单处理并标记后，-80℃冰箱保存，以避免实验操作前样品降解的可能性。 送样指南 01贴壁细胞收样（>1X107） （1）从培养箱中取出贴壁细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好。 （2）待细胞密度达70%~80%，加入放线菌酮(CHX, 终浓度为100μg/mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。 （3）胰酶（0.25%）消化后，收细胞同常规操作。最后加入预冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻 后放于-80℃保存备用。 02悬浮细胞（＞1X107） 03血液样本 外周血中，外周血单个核细胞（PBMC）在机体免疫中发挥了极其重要的作用。将血液中多核细胞和红细胞去除后，可分离出PBMC，从而能够方便地模拟体外的血液免疫环境。PBMC的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，其比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。通过利用介于两者比重之间的溶液(分层液或密度梯度分离液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与PBMC分离。具体操作如下： 1. 使用EDTA抗凝管（BD，0202992058）采集6 mL外周血。 2.将新鲜血液转移到15mL离心管中，室温2000rpm离心10min。 3. 用1mL移液器小心将上层血清吸出。 4. 将上述已去血清后的血液用生理盐水按照1:1（体积比）进行稀释，轻轻吹打3-5次混匀。 5. 将Ficoll试剂充分震荡，上下颠倒5-10次混匀，分装到15ml离心管中（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4），竖直放置到水平台面上静止备用。 6. 将稀释好的血液用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。（Ficoll溶液与稀释后的血液体积比为3:4） 7. 将离心管小心缓慢转移至离心机中，尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400×g，升降速为1，离心30分钟。 8. 离心结束后分4层，由下到上分别为红细胞、Ficoll溶液、淋巴细胞层、生理盐水。 9. 用移液枪吸取一部分生理盐水，将枪头插进淋巴细胞层中小心吸取，转移至新的15mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞造成污染。 10. 加入10mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，室温100×g，离心10min 。 11. 弃上清，加入1mL红细胞裂解液，裂解3min。室温300×g，离心5min。 12.弃上清，加入10mL生理盐水轻轻吹打混匀，室温100×g，8min离心。重复2次。 13. 弃上清，用1640完全培养基重悬细胞，加入放线菌酮(CHX, 终浓度为100μg/mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。 14. 同时取样进行台盼蓝染色，看细胞活率、细胞浓度。 15. 离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。 04动物组织样品（＞100mg） 斑马鱼胚胎 （1）当胚胎处于适当的阶段，去除绒毛膜(或手动或按标准方案使用pronase)。 （2）室温下E3培养基清洗2次。 （3）E3培养基中加入放线菌酮(100µg/mL)，室温下孵育胚胎5分钟。 （4）用移液器将胚胎转移到冰上的epppendorf试管中。 （5）在液氮中快速冷冻，在-80℃保存。 （6）填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 哺乳动物组织 注意：翻译是高度动态变化的，对内部和外部信号都有快速的反应。为了准确测量整个组织的体内翻译情况，必须尽快切除并快速冷冻相关组织，最大限度地减少了核糖体从转录本上脱落而引起的翻译变化。 （1）准备必要的手术工具，确保操作环境无RNase，备好液氮。 （2）按照实验室的标准程序，迅速处死动物并摘取目的组织。 （3）用高压灭菌后的无RNase PBS清洗组织，去除多余的结缔组织血液。 （4）在液氮中快速冷冻组织，冷冻后碾磨成粉末转移冻存管。 （5）-80度保存，干冰运输。 05植物组织（＞100mg）
（2）待细胞密度达70%~80%，加入放线菌酮(CHX, 终浓度为100μg /mL))到培养基阻滞翻译, 在37℃培养细胞15分钟。
（3）离心收集细胞后，加入预冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，转至冻存管后离心去上清，置于液氮中速冻后放于-80℃保存备用。
（2）立即投入液氮冷冻,冷冻后碾磨成粉末转移冻存管，-80度保存，干冰运输。
